反轉錄PCR（Reverse Transcription, RT-PCR）又稱為逆轉錄PCR，是指擴增mRNA的一種實驗技術。先將mRNA反轉錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴增。
（一）逆轉錄酶的種類
AMV：有較強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適42℃。在高反應溫度時可消除mRNA的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產生也限制其長度。
MMLV：有強的聚合酶活性，而RNA酶H活性較弱。較弱的RNA酶H活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。最適37℃。
Super RNaseH- Reverse Transcriptase：MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體，它能將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的模板合成較長的cDNA，最適42℃。（商品名為SuperScript和SuperScriptⅡ）
GoScript Reverse Transcriptase：專為 qPCR 而設計，利用 M-MLV 和先進的緩沖液技術獲得均衡穩定和可靠的 cDNA 合成結果，適合各種大小范圍的低豐度和高豐度的轉錄子，即使存在抑制劑也不受影響。
（二）引物的選擇
反轉錄引物有多種選擇，Oligo(dT)、隨機引物、基因特異性引物（GSP）等。
用來進行反轉錄的引物及其常用的推薦濃度如下表所示：
引物 | 常用終濃度 | 調整范圍 |
|---|---|---|
| Oligo(dT)15 | 0.025μg/μl | 0.01–0.125μg/μl |
| Random Primer | 0.025μg/μl | 0.01–0.1μg/μl |
| Oligo(dT)15＋Random Primer | 0.025μg/μl each primer | Each 0.01–0.1μg/μl |
| Gene-specific primer | 1μM | 0.5–0.1μM |
（表格引用Promega公司的 GoScript 反轉錄系統操作方法說明書）
（三）優化及注意事項
1. 逆轉錄PCR時，提取RNA是關鍵，需分離高質量RNA（純度和完整性）。
2. 整個操作過程需使用祛RNA酶耗槍頭及EP管。
3. 反轉錄過程中要謹防RNA酶的污染，加入RNA酶抑制劑。
4. 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。
5. 使用無RNaseH活性的逆轉錄酶
6. 提高逆轉錄酶保溫溫度
7. 減少基因組DNA污染
8. 對于反轉錄酶活性來說，二價陽離子是必需的。 對于大多數反轉錄反應，建議加入氯化鎂至鎂離子終濃度為2.5 mM 以得到最佳結果，可在1.5到5mM范圍內調整優化。對于長片段 RNA 的反轉錄，可以降低鎂離子濃度以提高延伸的完整性；短片段RNA的反轉錄，可以提高鎂離子濃度以提高反轉錄的效率。
iCell-CRO實驗外包服務介紹：
一站式細胞解決方案
針對基礎及臨床研發中的原代細胞和iPS細胞的實驗，由于原代細胞的分離和培養難度大，iPS細胞制作和分化的實驗操作復雜，除長期進行原代和iPS培養工作的實驗室，想要獲得足夠量的狀態好的細胞比較困難。
賽百慷依靠多年在細胞培養方面的積累，為客戶提供完整的細胞CRO解決方案。根據客戶需求，直接在細胞水平進行藥物或者試劑的刺激，觀察細胞狀態的變化或者特定通路上mRNA或蛋白的變化，也可以先制作動物模型，對動物進行處理后，分離特定的原代細胞進行需要的檢測。
同時，我們可以依照客戶提供的具體實驗方案進行操作，也可以根據客戶要求進行實驗設計，并根據客戶實驗的規模和難度提供詳細的報價和實驗周期規劃。
服務項目：
服務流程：
1.聯系我們，溝通客戶實驗計劃及目標，評估實驗的的可行性。
2.依照客戶要求，設計相應的實驗；或客戶已有實驗方案發送給我們，我們研究方案的可操作性。
3.確定最終的實驗方案，報價和周期。
4.簽訂服務合同，支付預付款。
5.開始實驗服務，并定期向客戶反饋和交流。
6.實驗完成，提供完整實驗說明和部分實驗結果。
7.支付尾款，向客戶提供完整的全部實驗報告和原始數據。
8.項目完成。
咨詢電話400-021-2021
忘記密碼?
立即注冊
