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一、背景介紹

免疫球蛋白（Ig）是一組具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)和免疫功能的球蛋白，存在于體液內(nèi)和淋巴細胞表面，是抗體的物質(zhì)基礎(chǔ)。按結(jié)構(gòu)和功能的不同分為五大類:IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。其分子大小、電荷、氨基酸組成和碳水化合物含量很不均一。Ig分子具有結(jié)合抗原和刺激抗體生成的雙重功能。IgG是血清中免疫球蛋白主成分，約占血清中免疫球蛋白總含量的75%，正常值為9.5~12.5mg/ml。其中40～50%分布于血清中，其余分布在組織中。正常人的IgG包括四個亞型，即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。這些亞型在補體激活的過程中結(jié)合能力各不相同。

二、實驗原理

本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附實驗雙抗夾心法檢測樣本中人 IgG的濃度。首先將樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品加入預(yù)包被有山羊抗人抗體的微孔中，利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點在特定條件下孵育，使樣本及標(biāo)準(zhǔn)品中的IgG被捕獲于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未結(jié)合的物質(zhì)，加入偶聯(lián)生物素的山羊抗人抗體，37℃條件下孵育，使包被抗體、人IgG及檢測抗體形成雙抗夾心復(fù)合物。洗板，再加入偶聯(lián)親和素的HRP，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)。最后加入顯色底物溶液。顯色結(jié)束后，加入硫酸溶液終止反應(yīng)，顏色由藍色變成黃色。樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品中IgG的含量與顯色顏色深淺成正比，據(jù)此可以計算待檢樣本中人 IgG的含量。

三、試劑盒改進

(1) 特異性高：包被抗體與檢測抗體分別識別同一抗原的不同特異性表位，增加了反應(yīng)的特異性。同類細胞因子之間沒有交叉反應(yīng)。

(2) 敏感性高：檢測抗體偶聯(lián)生物素，與親和素之間多價高親和力，級聯(lián)放大效應(yīng)使得實驗敏感度增加。

(3) 穩(wěn)定性高：實驗采用的是優(yōu)質(zhì)的包被抗體和抗原，并使用了特定的廣譜蛋白穩(wěn)定劑，和微孔板處理工藝，增加微孔板熱穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。

(4) 樣本稀釋液優(yōu)化：使用針對人血清樣本優(yōu)化后的特異性的緩沖液，排除樣本基質(zhì)干擾，適用于血清，血漿等常規(guī)樣本的細胞因子定量檢測。

四、提供的試劑及材料 

請將請按照試劑標(biāo)簽提示的貯存條件存放試劑，并請在保質(zhì)期前使用。

五、實驗需要但試劑盒未提供的材料 

1) 10-1000 μl移液器及一次性滅菌吸頭

2) 多道移液器

3) 滅菌的去離子水或超純水1L

4) 滅菌EP管

5) 吸水紙

6) 酶標(biāo)儀

7) 高速離心機

8) 洗板機或者洗瓶

9) 恒溫箱或水浴鍋 (37℃)

10) 數(shù)據(jù)分析及繪圖軟件

11) PBS(pH 7.4)的配制比例：NaH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，用蒸餾水稀釋至 1000mL。

六、樣本收集和保存

1) 血清：血液采集時不加抗凝劑，室溫靜置1-2小時，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

2) 血漿：血液采集時要加入總體積1%的抗凝劑（EDTA、肝素等），采集后先室溫或4℃靜置半小時后，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

3) 組織裂解液：組織裂解的方式取決于組織的類型，一般來講，先用預(yù)冷的PBS清洗組織后稱重。一般0.3g-0.5g組織加入500μL預(yù)冷的PBS，在冰上的玻璃容器內(nèi)研碎。用超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

4) 細胞裂解液：懸浮細胞直接離心取細胞沉淀。貼壁細胞需用胰酶消化后離心取細胞沉淀。檢測某些指標(biāo)時不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重懸細胞，超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

5) 細胞上清液：收集培養(yǎng)的細胞，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

樣本準(zhǔn)備注意事項：

u 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20°C (少于3個月) 或-80°C (少于6個月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反復(fù)凍融 如果要在24小時內(nèi)分析樣本，可以保存在2- 8°C。

u 某些化學(xué)裂解液可能會對本實驗造成干擾，比如SDS，Triton。謹慎使用。

u 樣本液中含有沉淀物會對ELISA有干擾，務(wù)必離心去除。

u 不要使用高脂血或溶血的樣本，對ELISA有干擾，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

u 不能加熱來融化樣本。

七、實驗前的準(zhǔn)備 

1) 請仔細閱讀試劑盒說明書，將水浴鍋或恒溫箱溫度設(shè)置為37℃。

2) 樣本的準(zhǔn)備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1min，取上清作為待檢樣本備用。

3) 樣本的稀釋倍數(shù)：如果您的樣本預(yù)測濃度高于本試劑盒最高檢測限度，建議使用PBS對樣本進行稀釋。根據(jù)實驗室建議，一般情況下至少稀釋倍數(shù)100萬倍，可根據(jù)實際情況調(diào)整稀釋倍數(shù)。

注意:

u 若預(yù)估待測樣本濃度超出試劑盒最高檢測限度，請進行預(yù)實驗以確定樣本稀釋倍數(shù)。

u 若您使用說明書中未列舉的樣本，請進行預(yù)實驗看本試劑盒是否適合您的實驗。

u 由于在細胞穩(wěn)定性，細胞數(shù)目，及采樣時間上存在差異，細胞培養(yǎng)上清樣本可能無法被本試劑盒檢測。

u 建議您使用新鮮的或者儲存時間不長的樣本用于分析測試。否則，樣本中蛋白質(zhì)的降解及變性會導(dǎo)致錯誤的實驗結(jié)果。

u 實驗樣本的最佳PH值在7.0-7.4之間。

八、試劑的準(zhǔn)備

1) 試劑盒內(nèi)所有試劑及包被板，請在使用前的30min拿出，使其恢復(fù)室溫。

2) 洗液的稀釋：量取10ml 100×洗液母液，加入990ml去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以穩(wěn)定保存2周。

3) 樣本的準(zhǔn)備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1min，取上清作為待檢樣本備用。

九、實驗步驟

1) 撕開包裝袋，取出包被有抗體的酶標(biāo)板，拆下不需要使用的板條，并用封口膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重復(fù)使用）

2) 向微孔板中加入8個標(biāo)準(zhǔn)品各100ul，向其余微孔中加入100ul的準(zhǔn)備好的分析樣本溶液。貼上封口膜，37℃孵育1.5h。

3) 洗板機洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機的洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機洗板5次。

? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無明顯水膜為止。

或手動洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無明顯液滴。

? 用多道移液槍向每個微孔中加300ul洗液，靜置20s，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復(fù)5次。注：第五次洗板時，充分拍干至無明顯水膜為止。

4) 加檢測抗體：取420ul檢測抗體母液（25×）加入對應(yīng)的稀釋液瓶中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100ul溶液，貼上封口膜，37℃孵育1h。然后洗板，按步驟3操作。

5) 加入HRP：取52.5ul HRP母液（200×）加入對應(yīng)的稀釋液瓶中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100ul溶液，貼上封口膜，37℃孵育45min。然后洗板，按步驟3操作。

6) 顯色：向每個孔中加入100ul底物TMB，輕輕震蕩30s混勻，貼上封口膜，置于避光的37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色10-30min。

注：震蕩速度要低于100rpm，液體濺出會影響后續(xù)OD值。顯色時間因?qū)嶒炇覘l件（溫度、濕度等）會有一定差異。

7) 顯色終止及讀板：直接向含有底物的微孔中加入50ul的終止液，終止反應(yīng)，輕輕震蕩混勻，立即轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上，在450nm下讀取吸光度值。

十、注意事項

（一）樣本收集注意事項

1、樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個月）或-80℃（少于6個月）以保持蛋白活性，避免污染和反復(fù)凍融。如果要在24小時內(nèi)分析樣本，可以保存在2-8℃。

2、采集樣本后如果短期內(nèi)不使用，請將樣本分裝后冷凍保存，避免反復(fù)凍融。冷凍樣本使用前請保證充分化凍，使用前用移液器或者Vortex混勻，可離心除去絮狀不溶物。

3、若母液（標(biāo)準(zhǔn)品，檢測抗體及酶液）出現(xiàn)渾濁，輕輕振蕩或吹打即可。

4、建議所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣本都設(shè)置復(fù)孔。向微孔中加入試劑或樣本后，請輕輕震蕩使液體混勻，并盡量保證不要有氣泡。

5、高脂血或溶血的樣本含有豐富的過氧化物酶，對ELISA有干擾，導(dǎo)致檢測結(jié)果非特異性升高，不建議使用。

（二）實驗操作注意事項

1、請不要將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。

2、實驗操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。

3、加樣：加樣時要控制時間和速度，一般加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。如果樣本數(shù)量過多，可使用多道移液器。

4、洗滌：洗滌時微孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5、由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請勿長時間暴露于可見光下。同時要避免TMB與金屬接觸。

6、反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

7、本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。

8、標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.95。

9、拍板示意圖:

十一、數(shù)據(jù)處理

1) 對樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各自對應(yīng)的復(fù)孔OD值取平均值。減去空白孔（即S8）OD值后帶入標(biāo)曲。

2) 以標(biāo)準(zhǔn)品的OD作為Y值，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為X值，推薦選擇四參數(shù)logistic (4-PL) 曲線擬合。

3) 將樣本OD代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計算樣本中待檢IgG的濃度。

4) 以下曲線僅供參考

附件一、標(biāo)準(zhǔn)曲線實例

十二、質(zhì)量控制

1) 批內(nèi)差CV%: 2.7-3.14

2) 批間差CV%: 8.4-9.6

3) 回收率%: 88.77-113.22

4) 線性: 

5) 靈敏度: 10.2 pg/ml

6) 特異性/交叉反應(yīng)性: 

7) 勾狀效應(yīng)（Hook Capacity）

本試劑盒是一個三步法的夾心ELISA試劑盒，樣本在高含量IgG的情況下會受到鉤狀效應(yīng)的影響。請用試劑盒稀釋液稀釋樣本，使其IgG濃度在本試劑盒的檢測范圍以內(nèi)。

8) 局限性

本試劑盒不適用于含有疊氮化鈉(NaN3)的樣本，因為疊氮化鈉是HRP的強抑制劑，會降低檢測到目的蛋白的濃度。

十三、安全注意事項

1) 本試劑盒顯色底物TMB 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine (TMB)，有一定的致病風(fēng)險。如果接觸到TMB，請用大量的水沖洗。

2) 終止液是硫酸溶液，請勿讓眼睛皮膚及衣物接觸終止液。操作時帶上手套，實驗服及面罩。