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一、背景介紹 

小鼠免疫球蛋白G（Mouse Immunogoblin G）是血清中免疫球蛋白主要成分，IgG主要由脾、淋巴結中的漿細胞合成和分泌，以單體形式存在。IgG約占血清中免疫球蛋白總量的75%。在體液中的正常值在mg/ml級別，其中40%-50%分布在血清中，其余分布在組織中。小鼠和動物的免疫血清中的免疫球蛋白極不均一，其組成、結構、大小、電荷、生物學活性等都有很大差異，約占機體全部血清蛋白的20～25％。目前已在小鼠、小鼠等血清中先后分離純化得到5類免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。根據(jù)IgG分子中γ鏈抗原性差異, 小鼠IgG分為4個亞類即IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。小鼠IgG可通過經(jīng)典途徑活化補體，其固定補體的能力依次IgG2b＞IgG2a＞IgG3，IgG1無固定補體的能力。

二、實驗原理

本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附實驗雙抗夾心法檢測樣本中Mouse IgG的濃度。首先將樣本或者標準品加入預包被有山羊抗鼠抗體的微孔中，利用抗原抗體特異性結合的特點在特定條件下孵育，使樣本及標準品中的IgG被捕獲于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未結合的物質，加入偶聯(lián)生物素的羊抗鼠抗體，37℃條件下孵育，使包被抗體、Mouse IgG及檢測抗體形成雙抗夾心復合物。洗板，再加入偶聯(lián)親和素的HRP，產生級聯(lián)放大效應。最后加入顯色底物溶液。顯色結束后，加入硫酸溶液終止反應，顏色由藍色變成黃色。樣本或者標準品中IgG的含量與顯色顏色深淺成正比，據(jù)此可以計算待檢樣本中Mouse IgG的含量。

三、試劑盒改進

(1) 特異性高：包被抗體與檢測抗體分別識別同一抗原的不同特異性表位，增加了反應的特異性。同類細胞因子之間沒有交叉反應。

(2) 敏感性高：檢測抗體偶聯(lián)生物素，與親和素之間多價高親和力，級聯(lián)放大效應使得實驗敏感度增加。

(3) 穩(wěn)定性高：實驗采用的是優(yōu)質的包被抗體和抗原，并使用了特定的廣譜蛋白穩(wěn)定劑，和微孔板處理工藝，增加微孔板熱穩(wěn)定性和結果的可重復性。

(4) 樣本稀釋液優(yōu)化：使用針對小鼠血清樣本優(yōu)化后的特異性的緩沖液，排除樣本基質干擾，適用于血清，血漿等常規(guī)樣本的細胞因子定量檢測。

四、提供的試劑及材料 

請將請按照試劑標簽提示的貯存條件存放試劑，并請在保質期前使用。

五、實驗需要但試劑盒未提供的材料 

1) 10-1000 μl移液器及一次性滅菌吸頭

2) 多道移液器

3) 滅菌的去離子水或超純水1L

4) 滅菌EP管

5) 吸水紙

6) 酶標儀

7) 高速離心機

8) 洗板機或者洗瓶

9) 恒溫箱或水浴鍋 (37℃)

10) 數(shù)據(jù)分析及繪圖軟件

11) PBS(pH 7.4)的配制比例：NaH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，用蒸餾水稀釋至 1000mL。

12) PBST配制方法：PBS+0.05%Tween-20。

六、樣本收集和保存

1) 血清：血液采集時不加抗凝劑，室溫靜置1-2小時，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

2) 血漿：血液采集時要加入總體積1%的抗凝劑（EDTA、肝素等），采集后先室溫或4℃靜置半小時后，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

3) 組織裂解液：組織裂解的方式取決于組織的類型，一般來講，先用預冷的PBS清洗組織后稱重。一般0.3g-0.5g組織加入500μL預冷的PBS，在冰上的玻璃容器內研碎。用超聲或者反復凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

4) 細胞裂解液：懸浮細胞直接離心取細胞沉淀。貼壁細胞需用胰酶消化后離心取細胞沉淀。檢測某些指標時不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重懸細胞，超聲或者反復凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

5) 細胞上清液：收集培養(yǎng)的細胞，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

樣本準備注意事項：

u 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20°C (少于3個月) 或-80°C (少于6個月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反復凍融 如果要在24小時內分析樣本，可以保存在2- 8°C。

u 某些化學裂解液可能會對本實驗造成干擾，比如SDS，Triton。謹慎使用。

u 樣本液中含有沉淀物會對ELISA有干擾，務必離心去除。

u 不要使用高脂血或溶血的樣本，對ELISA有干擾，導致檢測結果不準確。

u 不能加熱來融化樣本。

七、實驗前的準備 

1) 請仔細閱讀試劑盒說明書，將水浴鍋或恒溫箱溫度設置為37℃。

2) 樣本的準備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1min，取上清作為待檢樣本備用。

3) 樣本的稀釋倍數(shù)：如果您的樣本預測濃度高于本試劑盒最高檢測限度，建議使用PBS對樣本進行稀釋。根據(jù)實驗室建議，一般情況下至少稀釋倍數(shù)10000倍，可根據(jù)實際情況調整稀釋倍數(shù)。

注意:

u 若預估待測樣本濃度超出試劑盒最高檢測限度，請進行預實驗以確定樣本稀釋倍數(shù)。

u 若您使用說明書中未列舉的樣本，請進行預實驗看本試劑盒是否適合您的實驗。

u 由于在細胞穩(wěn)定性，細胞數(shù)目，及采樣時間上存在差異，細胞培養(yǎng)上清樣本可能無法被本試劑盒檢測。

u 建議您使用新鮮的或者儲存時間不長的樣本用于分析測試。否則，樣本中蛋白質的降解及變性會導致錯誤的實驗結果。

u 實驗樣本的最佳PH值在7.0-7.4之間。

八、試劑的準備

1) 試劑盒內所有試劑及包被板，請在使用前的30min拿出，使其恢復室溫。

2) 洗液的稀釋：量取10ml 100×洗液母液，加入990ml去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以穩(wěn)定保存2周。

3) 樣本的準備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1min，取上清作為待檢樣本備用。

九、實驗步驟

1) 撕開包裝袋，取出包被有抗體的酶標板，拆下不需要使用的板條，并用封口膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重復使用）

2) 向微孔板中加入8個標準品各100ul，向其余微孔中加入100ul的準備好的分析樣本溶液。貼上封口膜，37℃孵育1.5h。

3) 洗板機洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機的洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機洗板5次。

? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無明顯水膜為止。

或手動洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無明顯液滴。

? 用多道移液槍向每個微孔中加300ul洗液，靜置20s，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復5次。注：第五次洗板時，充分拍干至無明顯水膜為止。

4) 加檢測抗體：取165ul檢測抗體母液（66×）加入對應的稀釋液瓶中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100ul溶液，貼上封口膜，37℃孵育1h。然后洗板，按步驟3操作。

5) 加入HRP：取55ul HRP母液（200×）加入對應的稀釋液瓶中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100ul溶液，貼上封口膜，37℃孵育45min。然后洗板，按步驟3操作。

6) 顯色：向每個孔中加入100ul底物TMB，輕輕震蕩30s混勻，貼上封口膜，置于避光的37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色10-30min。

注：震蕩速度要低于100rpm，液體濺出會影響后續(xù)OD值。顯色時間因實驗室條件（溫度、濕度等）會有一定差異，顯色時間10-30min。

7) 顯色終止及讀板：直接向含有底物的微孔中加入50ul的終止液，終止反應，輕輕震蕩混勻，立即轉移到酶標儀上，在450nm下讀取吸光度值。

十、注意事項

（一）樣本收集注意事項

1、樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個月）或-80℃（少于6個月）以保持蛋白活性，避免污染和反復凍融。如果要在24小時內分析樣本，可以保存在2-8℃。

2、采集樣本后如果短期內不使用，請將樣本分裝后冷凍保存，避免反復凍融。冷凍樣本使用前請保證充分化凍，使用前用移液器或者Vortex混勻，可離心除去絮狀不溶物。

3、若母液（標準品，檢測抗體及酶液）出現(xiàn)渾濁，輕輕振蕩或吹打即可。

4、建議所有標準品及樣本都設置復孔。向微孔中加入試劑或樣本后，請輕輕震蕩使液體混勻，并盡量保證不要有氣泡。

5、高脂血或溶血的樣本含有豐富的過氧化物酶，對ELISA有干擾，導致檢測結果非特異性升高，不建議使用。

（二）實驗操作注意事項

1、請不要將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。

2、實驗操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。

3、加樣：加樣時要控制時間和速度，一般加樣時間控制在10分鐘內。如果樣本數(shù)量過多，可使用多道移液器。

4、洗滌：洗滌時微孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最后的酶標儀讀數(shù)。

5、由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請勿長時間暴露于可見光下。同時要避免TMB與金屬接觸。

6、反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應。

7、本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。

8、標準曲線的R2≥0.95。

9、拍板示意圖:

十一、數(shù)據(jù)處理

1) 對樣本及標準品各自對應的復孔OD值取平均值。減去空白孔（即S8）OD值后帶入標曲。

2) 以標準品的OD作為Y值，標準品的濃度作為X值，推薦選擇四參數(shù)logistic (4-PL) 曲線擬合。

3) 將樣本OD代入到標準曲線方程中計算樣本中待檢IgG的濃度

4) 以下曲線僅供參考。

附件一、標準曲線實例

十二、質量控制

1) 批內差CV%: 0.28-2.39

2) 批間差CV%: 0.27-2.92

3) 回收率%: 91.9-112

4) 線性: 

5) 靈敏度: 29.3 pg/ml

6) 特異性/交叉反應性: 

7) 勾狀效應（Hook Capacity）

本試劑盒是一個三步法的夾心ELISA試劑盒，樣本在高含量IgG的情況下會受到鉤狀效應的影響。本試劑盒樣本線性范圍大于100000倍，供參考使用。請用試劑盒稀釋液稀釋樣本，使其IgG濃度在本試劑盒的檢測范圍以內。

8) 局限性

本試劑盒不適用于含有疊氮化鈉(NaN3)的樣本，因為疊氮化鈉是HRP的強抑制劑，會降低檢測到目的蛋白的濃度。

十三、安全注意事項

1) 本試劑盒顯色底物TMB 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine (TMB)，有一定的致病風險。如果接觸到TMB，請用大量的水沖洗。

2) 終止液是硫酸溶液，請勿讓眼睛皮膚及衣物接觸終止液。操作時帶上手套，實驗服及面罩。