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一、背景介紹 

小鼠免疫球蛋白G（Mouse Immunogoblin G）是血清中免疫球蛋白主要成分，IgG主要由脾、淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌，以單體形式存在。IgG約占血清中免疫球蛋白總量的75%。在體液中的正常值在mg/ml級(jí)別，其中40%-50%分布在血清中，其余分布在組織中。小鼠和動(dòng)物的免疫血清中的免疫球蛋白極不均一，其組成、結(jié)構(gòu)、大小、電荷、生物學(xué)活性等都有很大差異，約占機(jī)體全部血清蛋白的20～25％。目前已在小鼠、小鼠等血清中先后分離純化得到5類免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。根據(jù)IgG分子中γ鏈抗原性差異, 小鼠IgG分為4個(gè)亞類即IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。小鼠IgG可通過(guò)經(jīng)典途徑活化補(bǔ)體，其固定補(bǔ)體的能力依次IgG2b＞IgG2a＞IgG3，IgG1無(wú)固定補(bǔ)體的能力。

二、實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗夾心法檢測(cè)樣本中Mouse IgG的濃度。首先將樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品加入預(yù)包被有山羊抗鼠抗體的微孔中，利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)在特定條件下孵育，使樣本及標(biāo)準(zhǔn)品中的IgG被捕獲于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未結(jié)合的物質(zhì)，加入偶聯(lián)生物素的羊抗鼠抗體，37℃條件下孵育，使包被抗體、Mouse IgG及檢測(cè)抗體形成雙抗夾心復(fù)合物。洗板，再加入偶聯(lián)親和素的HRP，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。最后加入顯色底物溶液。顯色結(jié)束后，加入硫酸溶液終止反應(yīng)，顏色由藍(lán)色變成黃色。樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品中IgG的含量與顯色顏色深淺成正比，據(jù)此可以計(jì)算待檢樣本中Mouse IgG的含量。

三、試劑盒改進(jìn)

(1) 特異性高：包被抗體與檢測(cè)抗體分別識(shí)別同一抗原的不同特異性表位，增加了反應(yīng)的特異性。同類細(xì)胞因子之間沒(méi)有交叉反應(yīng)。

(2) 敏感性高：檢測(cè)抗體偶聯(lián)生物素，與親和素之間多價(jià)高親和力，級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)使得實(shí)驗(yàn)敏感度增加。

(3) 穩(wěn)定性高：實(shí)驗(yàn)采用的是優(yōu)質(zhì)的包被抗體和抗原，并使用了特定的廣譜蛋白穩(wěn)定劑，和微孔板處理工藝，增加微孔板熱穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。

(4) 樣本稀釋液優(yōu)化：使用針對(duì)小鼠血清樣本優(yōu)化后的特異性的緩沖液，排除樣本基質(zhì)干擾，適用于血清，血漿等常規(guī)樣本的細(xì)胞因子定量檢測(cè)。

四、提供的試劑及材料 

請(qǐng)將請(qǐng)按照試劑標(biāo)簽提示的貯存條件存放試劑，并請(qǐng)?jiān)诒Ｙ|(zhì)期前使用。

五、實(shí)驗(yàn)需要但試劑盒未提供的材料 

1) 10-1000 μl移液器及一次性滅菌吸頭

2) 多道移液器

3) 滅菌的去離子水或超純水1L

4) 滅菌EP管

5) 吸水紙

6) 酶標(biāo)儀

7) 高速離心機(jī)

8) 洗板機(jī)或者洗瓶

9) 恒溫箱或水浴鍋 (37℃)

10) 數(shù)據(jù)分析及繪圖軟件

11) PBS(pH 7.4)的配制比例：NaH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g，用蒸餾水稀釋至 1000mL。

12) PBST配制方法：PBS+0.05%Tween-20。

六、樣本收集和保存

1) 血清：血液采集時(shí)不加抗凝劑，室溫靜置1-2小時(shí)，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

2) 血漿：血液采集時(shí)要加入總體積1%的抗凝劑（EDTA、肝素等），采集后先室溫或4℃靜置半小時(shí)后，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

3) 組織裂解液：組織裂解的方式取決于組織的類型，一般來(lái)講，先用預(yù)冷的PBS清洗組織后稱重。一般0.3g-0.5g組織加入500μL預(yù)冷的PBS，在冰上的玻璃容器內(nèi)研碎。用超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

4) 細(xì)胞裂解液：懸浮細(xì)胞直接離心取細(xì)胞沉淀。貼壁細(xì)胞需用胰酶消化后離心取細(xì)胞沉淀。檢測(cè)某些指標(biāo)時(shí)不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重懸細(xì)胞，超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

5) 細(xì)胞上清液：收集培養(yǎng)的細(xì)胞，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

樣本準(zhǔn)備注意事項(xiàng)：

u 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20°C (少于3個(gè)月) 或-80°C (少于6個(gè)月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反復(fù)凍融 如果要在24小時(shí)內(nèi)分析樣本，可以保存在2- 8°C。

u 某些化學(xué)裂解液可能會(huì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)造成干擾，比如SDS，Triton。謹(jǐn)慎使用。

u 樣本液中含有沉淀物會(huì)對(duì)ELISA有干擾，務(wù)必離心去除。

u 不要使用高脂血或溶血的樣本，對(duì)ELISA有干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

u 不能加熱來(lái)融化樣本。

七、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 

1) 請(qǐng)仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)，將水浴鍋或恒溫箱溫度設(shè)置為37℃。

2) 樣本的準(zhǔn)備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1min，取上清作為待檢樣本備用。

3) 樣本的稀釋倍數(shù)：如果您的樣本預(yù)測(cè)濃度高于本試劑盒最高檢測(cè)限度，建議使用PBS對(duì)樣本進(jìn)行稀釋。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室建議，一般情況下至少稀釋倍數(shù)10000倍，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整稀釋倍數(shù)。

注意:

u 若預(yù)估待測(cè)樣本濃度超出試劑盒最高檢測(cè)限度，請(qǐng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定樣本稀釋倍數(shù)。

u 若您使用說(shuō)明書(shū)中未列舉的樣本，請(qǐng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)看本試劑盒是否適合您的實(shí)驗(yàn)。

u 由于在細(xì)胞穩(wěn)定性，細(xì)胞數(shù)目，及采樣時(shí)間上存在差異，細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本可能無(wú)法被本試劑盒檢測(cè)。

u 建議您使用新鮮的或者儲(chǔ)存時(shí)間不長(zhǎng)的樣本用于分析測(cè)試。否則，樣本中蛋白質(zhì)的降解及變性會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 實(shí)驗(yàn)樣本的最佳PH值在7.0-7.4之間。

八、試劑的準(zhǔn)備

1) 試劑盒內(nèi)所有試劑及包被板，請(qǐng)?jiān)谑褂们暗?0min拿出，使其恢復(fù)室溫。

2) 洗液的稀釋：量取10ml 100×洗液母液，加入990ml去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請(qǐng)將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以穩(wěn)定保存2周。

3) 樣本的準(zhǔn)備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1min，取上清作為待檢樣本備用。

九、實(shí)驗(yàn)步驟

1) 撕開(kāi)包裝袋，取出包被有抗體的酶標(biāo)板，拆下不需要使用的板條，并用封口膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重復(fù)使用）

2) 向微孔板中加入8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品各100ul，向其余微孔中加入100ul的準(zhǔn)備好的分析樣本溶液。貼上封口膜，37℃孵育1.5h。

3) 洗板機(jī)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機(jī)的洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機(jī)洗板5次。

? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無(wú)明顯水膜為止。

或手動(dòng)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無(wú)明顯液滴。

? 用多道移液槍向每個(gè)微孔中加300ul洗液，靜置20s，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復(fù)5次。注：第五次洗板時(shí)，充分拍干至無(wú)明顯水膜為止。

4) 加檢測(cè)抗體：取165ul檢測(cè)抗體母液（66×）加入對(duì)應(yīng)的稀釋液瓶中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100ul溶液，貼上封口膜，37℃孵育1h。然后洗板，按步驟3操作。

5) 加入HRP：取55ul HRP母液（200×）加入對(duì)應(yīng)的稀釋液瓶中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100ul溶液，貼上封口膜，37℃孵育45min。然后洗板，按步驟3操作。

6) 顯色：向每個(gè)孔中加入100ul底物TMB，輕輕震蕩30s混勻，貼上封口膜，置于避光的37℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色10-30min。

注：震蕩速度要低于100rpm，液體濺出會(huì)影響后續(xù)OD值。顯色時(shí)間因?qū)嶒?yàn)室條件（溫度、濕度等）會(huì)有一定差異，顯色時(shí)間10-30min。

7) 顯色終止及讀板：直接向含有底物的微孔中加入50ul的終止液，終止反應(yīng)，輕輕震蕩混勻，立即轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上，在450nm下讀取吸光度值。

十、注意事項(xiàng)

（一）樣本收集注意事項(xiàng)

1、樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個(gè)月）或-80℃（少于6個(gè)月）以保持蛋白活性，避免污染和反復(fù)凍融。如果要在24小時(shí)內(nèi)分析樣本，可以保存在2-8℃。

2、采集樣本后如果短期內(nèi)不使用，請(qǐng)將樣本分裝后冷凍保存，避免反復(fù)凍融。冷凍樣本使用前請(qǐng)保證充分化凍，使用前用移液器或者Vortex混勻，可離心除去絮狀不溶物。

3、若母液（標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)抗體及酶液）出現(xiàn)渾濁，輕輕振蕩或吹打即可。

4、建議所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣本都設(shè)置復(fù)孔。向微孔中加入試劑或樣本后，請(qǐng)輕輕震蕩使液體混勻，并盡量保證不要有氣泡。

5、高脂血或溶血的樣本含有豐富的過(guò)氧化物酶，對(duì)ELISA有干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果非特異性升高，不建議使用。

（二）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

1、請(qǐng)不要將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。

2、實(shí)驗(yàn)操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。

3、加樣：加樣時(shí)要控制時(shí)間和速度，一般加樣時(shí)間控制在10分鐘內(nèi)。如果樣本數(shù)量過(guò)多，可使用多道移液器。

4、洗滌：洗滌時(shí)微孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5、由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請(qǐng)勿長(zhǎng)時(shí)間暴露于可見(jiàn)光下。同時(shí)要避免TMB與金屬接觸。

6、反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

7、本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。

8、標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.95。

9、拍板示意圖:

十一、數(shù)據(jù)處理

1) 對(duì)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各自對(duì)應(yīng)的復(fù)孔OD值取平均值。減去空白孔（即S8）OD值后帶入標(biāo)曲。

2) 以標(biāo)準(zhǔn)品的OD作為Y值，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為X值，推薦選擇四參數(shù)logistic (4-PL) 曲線擬合。

3) 將樣本OD代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算樣本中待檢IgG的濃度

4) 以下曲線僅供參考。

附件一、標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)例

十二、質(zhì)量控制

1) 批內(nèi)差CV%: 0.28-2.39

2) 批間差CV%: 0.27-2.92

3) 回收率%: 91.9-112

4) 線性: 

5) 靈敏度: 29.3 pg/ml

6) 特異性/交叉反應(yīng)性: 

7) 勾狀效應(yīng)（Hook Capacity）

本試劑盒是一個(gè)三步法的夾心ELISA試劑盒，樣本在高含量IgG的情況下會(huì)受到鉤狀效應(yīng)的影響。本試劑盒樣本線性范圍大于100000倍，供參考使用。請(qǐng)用試劑盒稀釋液稀釋樣本，使其IgG濃度在本試劑盒的檢測(cè)范圍以內(nèi)。

8) 局限性

本試劑盒不適用于含有疊氮化鈉(NaN3)的樣本，因?yàn)榀B氮化鈉是HRP的強(qiáng)抑制劑，會(huì)降低檢測(cè)到目的蛋白的濃度。

十三、安全注意事項(xiàng)

1) 本試劑盒顯色底物TMB 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine (TMB)，有一定的致病風(fēng)險(xiǎn)。如果接觸到TMB，請(qǐng)用大量的水沖洗。

2) 終止液是硫酸溶液，請(qǐng)勿讓眼睛皮膚及衣物接觸終止液。操作時(shí)帶上手套，實(shí)驗(yàn)服及面罩。