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一、背景介紹

牛免疫球蛋白G（IgG）是牛血清中免疫球蛋白主要成分，分子量約為160 kDa，其中40～50%分布于血清中，其余分布在組織中。IgG包括四個(gè)亞型，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，在血清中的含量為17-27mg/mL。牛IgG廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生化、教學(xué)、科研、生物醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域。各種通過生物技術(shù)流程生產(chǎn)的產(chǎn)品，例如細(xì)胞或組織培養(yǎng)基所使用的組分都可能導(dǎo)致所需要的產(chǎn)品殘留污染。由于胎牛血清中含有大量牛免疫球蛋白G，因此經(jīng)常被用作重組制藥生產(chǎn)中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的介質(zhì)。在重組制藥的純化過程中，經(jīng)過工藝優(yōu)化純化去除IgG，在重組蛋白藥物以及其他終產(chǎn)品中，仍可能有牛IgG的殘留。而當(dāng)產(chǎn)品被用作?；騽?dòng)物的治療劑時(shí)，牛IgG作為一種致敏物質(zhì)，可能會(huì)引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，影響到牛體健康，甚至直接威脅到患者的生命安全。因此，殘留牛IgG檢測是生物醫(yī)藥制品質(zhì)量控制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗夾心法檢測樣本中牛IgG的濃度。首先將樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品加入預(yù)包被有兔抗牛抗體的微孔中，利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)在特定條件下孵育，使樣本及標(biāo)準(zhǔn)品中的IgG被捕獲于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未結(jié)合的物質(zhì)，加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶的兔抗?？贵w，室溫條件下孵育，使包被抗體、牛IgG及檢測抗體形成雙抗夾心復(fù)合物。洗板后加入顯色底物溶液。顯色結(jié)束后，加入硫酸溶液終止反應(yīng)，顏色由藍(lán)色變成黃色。樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品中IgG的含量與顯色顏色深淺成正比，據(jù)此可以計(jì)算待檢樣本中牛IgG的含量。

三、試劑盒優(yōu)勢(shì)

1. 特異性高：包被抗體與檢測抗體分別識(shí)別同一抗原的不同特異性表位，增加了反應(yīng)的特異性，同類細(xì)胞因子之間沒有交叉反應(yīng)。

2. 穩(wěn)定性高：實(shí)驗(yàn)采用的是優(yōu)質(zhì)的包被抗體和抗原，并使用了特定的廣譜蛋白穩(wěn)定劑，和微孔板處理工藝，增加微孔板熱穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。

3. 樣本稀釋液優(yōu)化：使用針對(duì)牛血清樣本優(yōu)化后的特異性的緩沖液，排除樣本基質(zhì)干擾，適用于血清，血漿等常規(guī)樣本的細(xì)胞因子定量檢測。

四、試劑盒組分 

請(qǐng)將請(qǐng)按照試劑標(biāo)簽提示的貯存條件存放試劑，并請(qǐng)?jiān)诒Ｙ|(zhì)期前使用。

五、實(shí)驗(yàn)需要但未提供的耗材及設(shè)備

六、樣本收集和保存

1. 血清：血液采集時(shí)不加抗凝劑，室溫靜置1-2小時(shí)，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

2. 血漿：血液采集時(shí)要加入總體積1%的抗凝劑（EDTA、肝素等），采集后先室溫或4℃靜置半小時(shí)后，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

3. 組織裂解液：組織裂解的方式取決于組織的類型，一般來講，先用預(yù)冷的PBS清洗組織后稱重。一般0.3g-0.5g組織加入500μL預(yù)冷的PBS，在冰上的玻璃容器內(nèi)研碎。用超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

4. 細(xì)胞裂解液：懸浮細(xì)胞直接離心取細(xì)胞沉淀。貼壁細(xì)胞需用胰酶消化后離心取細(xì)胞沉淀。檢測某些指標(biāo)時(shí)不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重懸細(xì)胞，超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

5. 細(xì)胞上清液：收集培養(yǎng)的細(xì)胞，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

七、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 

1. 請(qǐng)仔細(xì)閱讀試劑盒說明書。

2. 樣本的準(zhǔn)備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1分鐘，取上清作為待檢樣本備用。

3. 樣本的稀釋倍數(shù)：如果您的樣本預(yù)測濃度高于本試劑盒最高檢測限度，建議使用PBS對(duì)樣本進(jìn)行稀釋。

注意:

u 若您使用說明書中未列舉的樣本，請(qǐng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)看本試劑盒是否適合您的實(shí)驗(yàn)。

u 由于在細(xì)胞穩(wěn)定性，細(xì)胞數(shù)目，及采樣時(shí)間上存在差異，細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本可能無法被本試劑盒檢測。

u 建議您使用新鮮的或者儲(chǔ)存時(shí)間不長的樣本用于分析測試。否則，樣本中蛋白質(zhì)的降解及變性會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 實(shí)驗(yàn)樣本的最佳PH值在7.0-7.4之間。

八、試劑的準(zhǔn)備

1. 試劑盒內(nèi)所有試劑及包被板，請(qǐng)?jiān)谑褂们暗?0分鐘拿出，使其恢復(fù)室溫。

2. 洗液的稀釋：量取10mL 100×洗液母液，加入990mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請(qǐng)將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以穩(wěn)定保存2周。

3. 稀釋液（1×）的準(zhǔn)備：將10mL稀釋液（10×），加入90mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請(qǐng)將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。

九、操作步驟

1. 撕開包裝袋，取出包被有抗體的酶標(biāo)板，拆下不需要使用的板條，并用封板膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重復(fù)使用）

2. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：配置標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)提前標(biāo)記7支樣品稀釋管，預(yù)加入一定體積的稀釋液，其中S1（1000μL），S2至S7（各250μL）。取1μL標(biāo)準(zhǔn)品母液（濃度為5μg/mL）加入到標(biāo)記為S1的管，吹打混勻后，取250μL濃度為5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S1到下一管，之后以2倍梯度稀釋至S7（稀釋過程如下圖）。

取100μL標(biāo)準(zhǔn)品及樣本（原液或稀釋液）加入微孔板中?？瞻讓?duì)照（Blank Control）加入100μL的樣本稀釋液即可。

注：標(biāo)準(zhǔn)曲線有7個(gè)點(diǎn)，分別命名為S1、S2、S3……S7。其中S1即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)（5000pg/mL）。

3. 封板膜將酶標(biāo)板用封板膜密封后室溫振蕩孵育1.5小時(shí)。

4. 洗板機(jī)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機(jī)的洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機(jī)洗板5次。

? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無明顯水膜為止。

或手動(dòng)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無明顯液滴。

? 用多道移液槍向每個(gè)微孔中加300μL洗液，靜置20秒，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復(fù)5次。

注：第五次洗板時(shí)，充分拍干至無明顯水膜為止。

5. 加檢測抗體：取100μL HRP標(biāo)記檢測抗體母液（100×）加入到10mL稀釋液（1×）中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100μL溶液，貼上封板膜，室溫孵育1小時(shí)。然后洗板，按步驟4操作。

6. 顯色：向每個(gè)孔中加入100μL底物TMB，輕輕震蕩30s混勻，貼上封板膜，置于室溫避光靜置顯色10-30分鐘。注：顯色時(shí)間因?qū)嶒?yàn)室條件（溫度、濕度等）會(huì)有一定差異。

7. 顯色終止及讀板：直接向含有底物的微孔中加入50μL的終止液，終止反應(yīng)，輕輕震蕩混勻，立即轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上，在450nm下讀取吸光度值。

十、注意事項(xiàng)

（一）樣本收集注意事項(xiàng)

1. 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個(gè)月）或-80℃（少于6個(gè)月）以保持蛋白活性，避免污染和反復(fù)凍融。如果要在24小時(shí)內(nèi)分析樣本，可以保存在2-8℃。

2. 冷凍樣本使用前請(qǐng)保證充分化凍（請(qǐng)勿加熱融化樣本），使用前用移液器或者Vortex混勻，樣本液中含有沉淀物會(huì)對(duì)ELISA有干擾，可離心去除。

3. 某些化學(xué)裂解液（如SDS，Triton等）可能會(huì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)造成干擾，謹(jǐn)慎使用。

4. 若母液（標(biāo)準(zhǔn)品，檢測抗體及酶液）出現(xiàn)渾濁，輕輕振蕩或吹打即可。

5. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣本都設(shè)置復(fù)孔。向微孔中加入試劑或樣本后，請(qǐng)輕輕震蕩使液體混勻，并盡量保證不要有氣泡。

6. 高脂血或溶血的樣本含有豐富的過氧化物酶，對(duì)ELISA有干擾，導(dǎo)致檢測結(jié)果非特異性升高，不建議使用。

（二）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

1. 請(qǐng)勿將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。

2. 實(shí)驗(yàn)操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。

3. 加樣時(shí)需控制時(shí)間和速度，一般控制在10分鐘內(nèi)。如果樣本數(shù)量過多，可使用多道移液器。

4. 洗滌時(shí)微孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最終的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5. 由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請(qǐng)勿長時(shí)間暴露于可見光下。同時(shí)要避免TMB與金屬接觸。

6. 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

7. 本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。

8. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.95。

9. 拍板示意圖：

十一、數(shù)據(jù)處理

1. 對(duì)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各自對(duì)應(yīng)的復(fù)孔OD值取平均值。減去空白孔（即S8）OD值后帶入標(biāo)曲。

2. 以標(biāo)準(zhǔn)品的OD作為Y值，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為X值，推薦選擇四參數(shù)logistic（4-PL）曲線擬合。

3. 將樣本OD代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算樣本中待檢IgG的濃度

4. 以下曲線僅供參考。

附件一、標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)例

十二、質(zhì)量控制

1. 批內(nèi)差CV%：0-4   批間差CV%：5-13

2. 回收率%：80-120

3. 線性：

4. 靈敏度: 26.8 pg/mL

5. 特異性/交叉反應(yīng)性: 

6. 勾狀效應(yīng)（Hook Capacity）：本試劑盒是三步法夾心ELISA，樣本在高濃度IgG的情況下會(huì)受到鉤狀效應(yīng)的影響?？墒褂孟♂屢簩颖緷舛认♂屩帘驹噭┖械臋z測范圍以內(nèi)。

7. 局限性：本試劑盒不適用于含有疊氮化鈉（NaN3）的樣本，因?yàn)榀B氮化鈉是HRP的強(qiáng)抑制劑，會(huì)降低檢測到目的蛋白的濃度。

十三、安全注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒顯色底物TMB 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine (TMB)，有一定的致病風(fēng)險(xiǎn)。如果接觸到TMB，請(qǐng)用大量的水沖洗。

2. 終止液是硫酸溶液，請(qǐng)勿讓眼睛皮膚及衣物接觸終止液。操作時(shí)帶上手套，實(shí)驗(yàn)服及面罩。