一、背景介紹
牛免疫球蛋白G（IgG）是牛血清中免疫球蛋白主要成分，分子量約為160 kDa，其中40～50%分布于血清中，其余分布在組織中。IgG包括四個亞型，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，在血清中的含量為17-27mg/mL。牛IgG廣泛應用于基礎生化、教學、科研、生物醫藥生產等領域。各種通過生物技術流程生產的產品，例如細胞或組織培養基所使用的組分都可能導致所需要的產品殘留污染。由于胎牛血清中含有大量牛免疫球蛋白G，因此經常被用作重組制藥生產中培養哺乳動物細胞的介質。在重組制藥的純化過程中，經過工藝優化純化去除IgG，在重組蛋白藥物以及其他終產品中，仍可能有牛IgG的殘留。而當產品被用作牛或動物的治療劑時，牛IgG作為一種致敏物質，可能會引起免疫應答反應，影響到牛體健康，甚至直接威脅到患者的生命安全。因此，殘留牛IgG檢測是生物醫藥制品質量控制中的一個重要環節。
二、實驗原理
本試劑盒采用酶聯免疫吸附實驗雙抗夾心法檢測樣本中牛IgG的濃度。首先將樣本或者標準品加入預包被有兔抗牛抗體的微孔中，利用抗原抗體特異性結合的特點在特定條件下孵育，使樣本及標準品中的IgG被捕獲于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未結合的物質，加入偶聯辣根過氧化物酶的兔抗牛抗體，室溫條件下孵育，使包被抗體、牛IgG及檢測抗體形成雙抗夾心復合物。洗板后加入顯色底物溶液。顯色結束后，加入硫酸溶液終止反應，顏色由藍色變成黃色。樣本或者標準品中IgG的含量與顯色顏色深淺成正比，據此可以計算待檢樣本中牛IgG的含量。
三、試劑盒優勢
1. 特異性高：包被抗體與檢測抗體分別識別同一抗原的不同特異性表位，增加了反應的特異性，同類細胞因子之間沒有交叉反應。
2. 穩定性高：實驗采用的是優質的包被抗體和抗原，并使用了特定的廣譜蛋白穩定劑，和微孔板處理工藝，增加微孔板熱穩定性和結果的可重復性。
3. 樣本稀釋液優化：使用針對牛血清樣本優化后的特異性的緩沖液，排除樣本基質干擾，適用于血清，血漿等常規樣本的細胞因子定量檢測。
四、試劑盒組分
請將請按照試劑標簽提示的貯存條件存放試劑，并請在保質期前使用。
名稱 | 規格 | 數量 | 保存 | |
1 | 已包被平底微孔板 | 96孔 | 1板（可拆卸） | 2-8℃密封冷藏 |
2 | 標準品母液（5μg/mL） | 10μL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
3 | HRP標記檢測抗體母液（100×） | 150μL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
4 | 稀釋液（10×） | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
5 | TMB | 10mL | 1瓶 | 2-8℃避光冷藏 |
6 | 終止液 | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
7 | 洗液（100×） | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
8 | 封板膜 | 4張 | ||
9 | 使用說明書 | 1份 |
五、實驗需要但未提供的耗材及設備
1. | 移液器：10μL-1000μL | 7. | 多道移液器 |
2. | 滅菌的去離子水或超純水1L | 8. | 滅菌EP管 |
3. | 吸水紙 | 9. | 酶標儀 |
4. | 高速離心機 | 10. | 洗板機或者洗瓶 |
5. | 恒溫箱或水浴鍋 (可選) | 11. | 數據分析及繪圖軟件 |
6. | PBS（pH 7.4）配制方法：NaH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g， | ||
用蒸餾水稀釋至1000mL。 | |||
六、樣本收集和保存
1. 血清：血液采集時不加抗凝劑，室溫靜置1-2小時，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
2. 血漿：血液采集時要加入總體積1%的抗凝劑（EDTA、肝素等），采集后先室溫或4℃靜置半小時后，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
3. 組織裂解液：組織裂解的方式取決于組織的類型，一般來講，先用預冷的PBS清洗組織后稱重。一般0.3g-0.5g組織加入500μL預冷的PBS，在冰上的玻璃容器內研碎。用超聲或者反復凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
4. 細胞裂解液：懸浮細胞直接離心取細胞沉淀。貼壁細胞需用胰酶消化后離心取細胞沉淀。檢測某些指標時不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重懸細胞，超聲或者反復凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
5. 細胞上清液：收集培養的細胞，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
七、實驗前的準備
1. 請仔細閱讀試劑盒說明書。
2. 樣本的準備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1分鐘，取上清作為待檢樣本備用。
3. 樣本的稀釋倍數：如果您的樣本預測濃度高于本試劑盒最高檢測限度，建議使用PBS對樣本進行稀釋。
注意:
u 若您使用說明書中未列舉的樣本，請進行預實驗看本試劑盒是否適合您的實驗。
u 由于在細胞穩定性，細胞數目，及采樣時間上存在差異，細胞培養上清樣本可能無法被本試劑盒檢測。
u 建議您使用新鮮的或者儲存時間不長的樣本用于分析測試。否則，樣本中蛋白質的降解及變性會導致錯誤的實驗結果。
u 實驗樣本的最佳PH值在7.0-7.4之間。
八、試劑的準備
1. 試劑盒內所有試劑及包被板，請在使用前的30分鐘拿出，使其恢復室溫。
2. 洗液的稀釋：量取10mL 100×洗液母液，加入990mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以穩定保存2周。
3. 稀釋液（1×）的準備：將10mL稀釋液（10×），加入90mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。
九、操作步驟
1. 撕開包裝袋，取出包被有抗體的酶標板，拆下不需要使用的板條，并用封板膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重復使用）
2. 標準品的稀釋：配置標準品時提前標記7支樣品稀釋管，預加入一定體積的稀釋液，其中S1（1000μL），S2至S7（各250μL）。取1μL標準品母液（濃度為5μg/mL）加入到標記為S1的管，吹打混勻后，取250μL濃度為5ng/mL的標準品S1到下一管，之后以2倍梯度稀釋至S7（稀釋過程如下圖）。
取100μL標準品及樣本（原液或稀釋液）加入微孔板中。空白對照（Blank Control）加入100μL的樣本稀釋液即可。
注：標準曲線有7個點，分別命名為S1、S2、S3……S7。其中S1即標準曲線的最高濃度點（5000pg/mL）。
3. 封板膜將酶標板用封板膜密封后室溫振蕩孵育1.5小時。
4. 洗板機洗板：
? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機的洗瓶中備用。
? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機洗板5次。
? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無明顯水膜為止。
或手動洗板：
? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。
? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無明顯液滴。
? 用多道移液槍向每個微孔中加300μL洗液，靜置20秒，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復5次。
注：第五次洗板時，充分拍干至無明顯水膜為止。
5. 加檢測抗體：取100μL HRP標記檢測抗體母液（100×）加入到10mL稀釋液（1×）中，輕輕震蕩混勻，使其充分稀釋至工作濃度后（1×），各孔加100μL溶液，貼上封板膜，室溫孵育1小時。然后洗板，按步驟4操作。
6. 顯色：向每個孔中加入100μL底物TMB，輕輕震蕩30s混勻，貼上封板膜，置于室溫避光靜置顯色10-30分鐘。注：顯色時間因實驗室條件（溫度、濕度等）會有一定差異。
7. 顯色終止及讀板：直接向含有底物的微孔中加入50μL的終止液，終止反應，輕輕震蕩混勻，立即轉移到酶標儀上，在450nm下讀取吸光度值。
十、注意事項
（一）樣本收集注意事項
1. 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個月）或-80℃（少于6個月）以保持蛋白活性，避免污染和反復凍融。如果要在24小時內分析樣本，可以保存在2-8℃。
2. 冷凍樣本使用前請保證充分化凍（請勿加熱融化樣本），使用前用移液器或者Vortex混勻，樣本液中含有沉淀物會對ELISA有干擾，可離心去除。
3. 某些化學裂解液（如SDS，Triton等）可能會對本實驗造成干擾，謹慎使用。
4. 若母液（標準品，檢測抗體及酶液）出現渾濁，輕輕振蕩或吹打即可。
5. 建議所有標準品及樣本都設置復孔。向微孔中加入試劑或樣本后，請輕輕震蕩使液體混勻，并盡量保證不要有氣泡。
6. 高脂血或溶血的樣本含有豐富的過氧化物酶，對ELISA有干擾，導致檢測結果非特異性升高，不建議使用。
（二）實驗操作注意事項
1. 請勿將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。
2. 實驗操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。
3. 加樣時需控制時間和速度，一般控制在10分鐘內。如果樣本數量過多，可使用多道移液器。
4. 洗滌時微孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最終的酶標儀讀數。
5. 由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請勿長時間暴露于可見光下。同時要避免TMB與金屬接觸。
6. 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請提前加入終止液終止反應。
7. 本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。
8. 標準曲線的R2≥0.95。
9. 拍板示意圖：
十一、數據處理
1. 對樣本及標準品各自對應的復孔OD值取平均值。減去空白孔（即S8）OD值后帶入標曲。
2. 以標準品的OD作為Y值，標準品的濃度作為X值，推薦選擇四參數logistic（4-PL）曲線擬合。
3. 將樣本OD代入到標準曲線方程中計算樣本中待檢IgG的濃度
4. 以下曲線僅供參考。
附件一、標準曲線實例
十二、質量控制
1. 批內差CV%：0-4 批間差CV%：5-13
2. 回收率%：80-120
3. 線性：
稀釋倍數 | 范圍 % |
1：2 | 87.54-100.00 |
1：4 | 100.10-103.98 |
1：8 | 98.75-107.51 |
1：16 | 101.64-105.10 |
1：32 | 100.80-102.80 |
4. 靈敏度: 26.8 pg/mL
5. 特異性/交叉反應性:
樣品 | 交叉反應率（%） |
Mouse IgG | 0.033 |
Goat IgG | 0.266 |
Human IgG | 0.019 |
6. 勾狀效應（Hook Capacity）：本試劑盒是三步法夾心ELISA，樣本在高濃度IgG的情況下會受到鉤狀效應的影響。可使用稀釋液將樣本濃度稀釋至本試劑盒的檢測范圍以內。
樣本稀釋倍數 | OD450 |
1 | 1.646 |
10 | 3.763 |
1000 | 3.448 |
100000 | 3.6 |
10000000 | 3.685 |
1000000000 | 3.258 |
10000000000 | 1.618 |
7. 局限性：本試劑盒不適用于含有疊氮化鈉（NaN3）的樣本，因為疊氮化鈉是HRP的強抑制劑，會降低檢測到目的蛋白的濃度。
十三、安全注意事項
1. 本試劑盒顯色底物TMB 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine (TMB)，有一定的致病風險。如果接觸到TMB，請用大量的水沖洗。
2. 終止液是硫酸溶液，請勿讓眼睛皮膚及衣物接觸終止液。操作時帶上手套，實驗服及面罩。
應用：定量檢測牛血清、血漿、細胞液、體液以及組織勻漿中IgG的含量
用途：本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床及診斷使用！
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