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一、背景介紹 

金黃色葡萄球菌蛋白A（Protein A或者SPA)是一種42kDa的MSCRAMM(Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix MolecμLes) 表面蛋白，其最初發(fā)現(xiàn)于Staphylococcus aureus細(xì)胞壁中。它由五個(gè)同源的免疫球蛋白結(jié)合亞基組成，五個(gè)亞基進(jìn)一步折疊形成3個(gè)螺旋束。每一個(gè)亞基可以結(jié)合來(lái)源于不同哺乳動(dòng)物的蛋白，主要是IgGs。蛋白A能夠以高親和力與人IgG1，人IgG2，以及小鼠IgG2a 和IgG2b結(jié)合。蛋白A能夠以中等親和力和人IgM, IgA和IgE，及小鼠IgG3和 IgG1結(jié)合。蛋白A不會(huì)和人的IgG3和IgD結(jié)合，也不會(huì)和IgM, IgA 和IgE反應(yīng)。

蛋白A對(duì)抗體高親和力使得生物醫(yī)藥界廣泛將蛋白A用于工業(yè)生產(chǎn)，生物醫(yī)藥上使用的用于生產(chǎn)抗體的蛋白A大部分都是結(jié)合到固定相層析樹脂。

親和層析中使用的蛋白A即使通過(guò)共價(jià)鍵連接到瓊脂糖基架上，也會(huì)有少量從層析柱上脫落，進(jìn)入到洗脫池中。這種生產(chǎn)過(guò)程中的蛋白A的泄漏可能會(huì)污染純化抗體的制備。蛋白A具有與多種宿主相互作用的能力，這表明它有可能在金黃色葡萄球菌感染中是一種毒力因子。

目前市場(chǎng)上純化抗體的Protein A主要為天然結(jié)構(gòu)及大腸桿菌來(lái)源的重組表達(dá)產(chǎn)物，這2類Protein A結(jié)構(gòu)基本相同。除此外之，市場(chǎng)上還存在一類非天然來(lái)源且結(jié)構(gòu)上與前2類有較大差別的Protein A，如GE的MabSelect SuReTM系列，由于這種Protein A結(jié)構(gòu)的特殊性，因此部分抗體能不同程度的與這類結(jié)構(gòu)特異的Protein A結(jié)合，而常規(guī)處理方法不能完全徹底的將其分開，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。

為了保證利用蛋白A親和層析純化的抗體的質(zhì)量我們研發(fā)了Protein A ELISA試劑盒（變性法）。本試劑盒在抗體濃度很高的情況下比如純化的抗體終產(chǎn)品中也可以檢測(cè)蛋白A的濃度。

該蛋白A檢測(cè)試劑盒采用變性方式徹底分離與非天然蛋白A結(jié)合的抗體產(chǎn)物，消除檢測(cè)過(guò)程中存在的抗體抑制，能在確保操作簡(jiǎn)單，高靈敏度的前提下檢測(cè)到低于3pg/mL的雜質(zhì)，提供準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。專門適用于治療性蛋白及抗體純化過(guò)程中殘留的蛋白A檢測(cè)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗夾心法檢測(cè)樣本中蛋白A的濃度。Elisa實(shí)驗(yàn)開始前，首先將待測(cè)樣本及梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品與變性液混合，室溫孵育使Protein A與抗體完全分離。待預(yù)處理完成后，先向預(yù)包被有雞抗蛋白A抗體的微孔中加入檢測(cè)抗體，后加入上述變性處理的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品，利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)在室溫下孵育，使樣本及標(biāo)準(zhǔn)品中的蛋白A被捕獲于聚丙烯微孔板上，經(jīng)一段時(shí)間孵育后，使包被抗體、蛋白A及檢測(cè)抗體形成雙抗夾心復(fù)合物，洗板，洗去其它未結(jié)合的物質(zhì)。加入顯色底物溶液。顯色結(jié)束后，加入硫酸溶液終止反應(yīng)，顏色由藍(lán)色變成黃色。樣本或者標(biāo)準(zhǔn)品中蛋白A的含量與顯色顏色深淺成正比，據(jù)此可以計(jì)算待檢樣本中蛋白A的含量。

三、試劑盒優(yōu)勢(shì)

1. 穩(wěn)定性高：實(shí)驗(yàn)采用特定的廣譜蛋白穩(wěn)定劑和微孔板處理工藝，增加微孔板熱穩(wěn)定性和結(jié)果的可重復(fù)性。

2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)間短：經(jīng)優(yōu)化后整個(gè)過(guò)程只需1.5小時(shí)，較傳統(tǒng)煮沸法大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

四、試劑盒組分

請(qǐng)將請(qǐng)按照試劑標(biāo)簽提示的貯存條件存放試劑，并請(qǐng)?jiān)诒Ｙ|(zhì)期前使用。

五、實(shí)驗(yàn)需要但未提供的耗材及設(shè)備

六、樣本收集和保存

1. 血清：血液采集時(shí)不加抗凝劑，室溫靜置1-2小時(shí)，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

2. 血漿：血液采集時(shí)要加入總體積1%的抗凝劑（EDTA、肝素等），采集后先室溫或4℃靜置半小時(shí)后，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

3. 組織裂解液：組織裂解的方式取決于組織的類型，一般來(lái)講，先用預(yù)冷的PBS清洗組織后稱重。一般0.3g-0.5g組織加入500μL預(yù)冷的PBS，在冰上的玻璃容器內(nèi)研碎。用超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

4. 細(xì)胞裂解液：懸浮細(xì)胞直接離心取細(xì)胞沉淀。貼壁細(xì)胞需用胰酶消化后離心取細(xì)胞沉淀。檢測(cè)某些指標(biāo)時(shí)不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重懸細(xì)胞，超聲或者反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

5. 細(xì)胞上清液：收集培養(yǎng)的細(xì)胞，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/span>

七、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 

1. 請(qǐng)仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書，實(shí)驗(yàn)過(guò)程在室溫下操作即可(20-25℃），如溫度較高或較低，可置于37℃恒溫培養(yǎng)箱。

2. 樣本的準(zhǔn)備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1分鐘，取上清作為待檢樣本備用。

注意:

u 若您使用說(shuō)明書中未列舉的樣本，請(qǐng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)看本試劑盒是否適合您的實(shí)驗(yàn)。

u 由于在細(xì)胞穩(wěn)定性，細(xì)胞數(shù)目，及采樣時(shí)間上存在差異，細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本可能無(wú)法被本試劑盒檢測(cè)。

u 建議您使用新鮮的或者儲(chǔ)存時(shí)間不長(zhǎng)的樣本用于分析測(cè)試。否則，樣本中蛋白質(zhì)的降解及變性會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 實(shí)驗(yàn)樣本的最佳PH值在7.0-7.4之間。

八、試劑的準(zhǔn)備

1. 實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)將所有試劑及樣本恢復(fù)到室溫（20-25℃）。

2. 洗液的稀釋：量取10mL 100×洗液母液，加入990mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請(qǐng)將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以穩(wěn)定保存2周。

3. 樣本稀釋液（1×）：量取10mL 10×稀釋液母液，加入90mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結(jié)晶，請(qǐng)將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解，1×稀釋液制備后請(qǐng)盡快用完。

4. 樣本的預(yù)稀釋：如果您的樣本預(yù)測(cè)濃度高于本試劑盒最高檢測(cè)限度，建議使用PBS對(duì)樣本進(jìn)行稀釋。

5. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：配置標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)提前標(biāo)記7只樣品稀釋管，預(yù)加入一定體積的稀釋液，即S1（499μL），S2至S7（各150μL）。取標(biāo)準(zhǔn)品母液（濃度為1μg/mL）1μL加入到標(biāo)記為S1的管中，吹打混勻后，取150μL濃度為2000pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品S1到下一管，之后以2倍梯度稀釋至S7（稀釋過(guò)程如下圖）注：標(biāo)準(zhǔn)曲線有7個(gè)點(diǎn)，分別命名為S1、S2、S3……S7。其中S即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)（2000pg/mL）。

6. 標(biāo)準(zhǔn)品/樣本的準(zhǔn)備：將稀釋好的待測(cè)樣本及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品與樣品預(yù)處理液按照2:1體積混合(如 100μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入50μL預(yù)處理液)，輕輕吹打10-15次，室溫，靜置孵育5-10分鐘備用。

7.  HRP標(biāo)記抗體工作液（1×）：取100μL HRP標(biāo)記抗體（100×），加入10mL檢測(cè)抗體稀釋液（1×），混勻即可。

九、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 撕開包裝袋，取出包被有抗體的酶標(biāo)板，拆下不需要使用的板條，并用封板膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重復(fù)使用）

2. 向微孔板中先加入100μL HRP標(biāo)記抗體工作液（1×），再加入25μL經(jīng)預(yù)處理的7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品，貼上封板膜，室溫，400-600rpm，孵育1小時(shí)。

注：加入25μL標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品時(shí)保持槍頭在抗體液面以下，避免產(chǎn)生氣泡。

3. 洗板機(jī)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機(jī)的洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機(jī)洗板5次。

? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無(wú)明顯水膜為止。

或手動(dòng)洗板：

? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。

? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無(wú)明顯液滴。

? 用多道移液槍向每個(gè)微孔中加300μL洗液，靜置20s，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復(fù)5次。注：第五次洗板時(shí)，充分拍干至無(wú)明顯水膜為止。

4. 顯色：向每個(gè)孔中加入100μL底物TMB，貼上封板膜，室溫環(huán)境下，靜置避光顯色10-30min。

5. 顯色終止及讀板：直接向含有底物的微孔中加入50μL的終止液，終止反應(yīng)，輕輕震蕩混勻，立即轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)儀上，在450nm下讀取吸光度值。

十、注意事項(xiàng)

（一）樣本收集注意事項(xiàng)

1. 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個(gè)月）或-80℃（少于6個(gè)月）以保持蛋白活性，避免污染和反復(fù)凍融。如果要在24小時(shí)內(nèi)分析樣本，可以保存在2-8℃。

2. 冷凍樣本使用前請(qǐng)保證充分化凍（請(qǐng)勿加熱融化樣本），使用前用移液器或者Vortex混勻，樣本液中含有沉淀物會(huì)對(duì)ELISA有干擾，可離心去除。

3. 某些化學(xué)裂解液（如SDS，Triton等）可能會(huì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)造成干擾，謹(jǐn)慎使用。

4. 若母液（標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)抗體及酶液）出現(xiàn)渾濁，輕輕振蕩或吹打即可。

5. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣本都設(shè)置復(fù)孔。向微孔中加入試劑或樣本后，請(qǐng)輕輕震蕩使液體混勻，并盡量保證不要有氣泡。

6. 高脂血或溶血的樣本含有豐富的過(guò)氧化物酶，對(duì)ELISA有干擾，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果非特異性升高，不建議使用。

（二）實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

1. 請(qǐng)不要將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。

2. 實(shí)驗(yàn)操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。

3. 加樣：加樣時(shí)要控制時(shí)間和速度，一般加樣時(shí)間控制在10分鐘內(nèi)。如果樣本數(shù)量過(guò)多，可使用多道移液器。

4. 洗滌：洗滌時(shí)微孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5. 由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請(qǐng)勿長(zhǎng)時(shí)間暴露于可見光下。同時(shí)要避免TMB與金屬接觸。

6. 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

7. 本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。

8. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.95。

9. 拍板示意圖:

十一、數(shù)據(jù)處理

1. 對(duì)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各自對(duì)應(yīng)的復(fù)孔OD值取平均值。減去空白孔OD值后帶入標(biāo)曲。

2. 以標(biāo)準(zhǔn)品的OD作為Y值，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為X值，推薦選擇四參數(shù)logistic (4-PL) 曲線擬合。

3. 將樣本OD代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算樣本中待檢樣本的濃度。

4. 以下曲線僅供參考。

               附件一、標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)例

十二、質(zhì)量控制

1. 批內(nèi)差：7-8%   批間差：6-9%

2. 靈敏度 LOD：3.9pg/mL   LOQ：31.25pg/mL

3. 回收率：初次實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)通過(guò)加標(biāo)回收率確認(rèn)樣品基質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有無(wú)干擾。建議每3倍體積的待測(cè)樣本加入1倍體積的標(biāo)準(zhǔn)品（S1：2000pg/mL），計(jì)算時(shí)采用加標(biāo)后樣品實(shí)際濃度減去加標(biāo)前樣品實(shí)際濃度，除以理論濃度即500pg/mL，判斷回收率是否在80-120%。對(duì)樣品檢測(cè)有干擾的基質(zhì)來(lái)源主要有極端pH值（pH<5或pH>8.5），較高鹽濃度及去污劑等會(huì)導(dǎo)致回收率偏低。有時(shí)高濃度的抗體產(chǎn)物也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，建議多稀釋幾個(gè)倍數(shù)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4. 勾狀效應(yīng)（Hook Capacity）：本試劑盒是一個(gè)三步法的夾心ELISA試劑盒，樣本在高含量蛋白A的情況下會(huì)受到鉤狀效應(yīng)的影響，請(qǐng)用試劑盒稀釋液稀釋樣本，使其蛋白A濃度在本試劑盒的檢測(cè)范圍以內(nèi)。

5. 局限性：本試劑盒不適用于含有疊氮化鈉(NaN3)的樣本，因?yàn)榀B氮化鈉是HRP的強(qiáng)抑制劑，會(huì)降低檢測(cè)到的蛋白A濃度。