一、背景介紹
金黃色葡萄球菌蛋白A（Protein A或者SPA)是一種42kDa的MSCRAMM(Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix MolecμLes) 表面蛋白，其最初發現于Staphylococcus aureus細胞壁中。它由五個同源的免疫球蛋白結合亞基組成，五個亞基進一步折疊形成3個螺旋束。每一個亞基可以結合來源于不同哺乳動物的蛋白，主要是IgGs。蛋白A能夠以高親和力與人IgG1，人IgG2，以及小鼠IgG2a 和IgG2b結合。蛋白A能夠以中等親和力和人IgM, IgA和IgE，及小鼠IgG3和 IgG1結合。蛋白A不會和人的IgG3和IgD結合，也不會和IgM, IgA 和IgE反應。
蛋白A對抗體高親和力使得生物醫藥界廣泛將蛋白A用于工業生產，生物醫藥上使用的用于生產抗體的蛋白A大部分都是結合到固定相層析樹脂。
親和層析中使用的蛋白A即使通過共價鍵連接到瓊脂糖基架上，也會有少量從層析柱上脫落，進入到洗脫池中。這種生產過程中的蛋白A的泄漏可能會污染純化抗體的制備。蛋白A具有與多種宿主相互作用的能力，這表明它有可能在金黃色葡萄球菌感染中是一種毒力因子。
目前市場上純化抗體的Protein A主要為天然結構及大腸桿菌來源的重組表達產物，這2類Protein A結構基本相同。除此外之，市場上還存在一類非天然來源且結構上與前2類有較大差別的Protein A，如GE的MabSelect SuReTM系列，由于這種Protein A結構的特殊性，因此部分抗體能不同程度的與這類結構特異的Protein A結合，而常規處理方法不能完全徹底的將其分開，導致定量不準確。
為了保證利用蛋白A親和層析純化的抗體的質量我們研發了Protein A ELISA試劑盒（變性法）。本試劑盒在抗體濃度很高的情況下比如純化的抗體終產品中也可以檢測蛋白A的濃度。
該蛋白A檢測試劑盒采用變性方式徹底分離與非天然蛋白A結合的抗體產物，消除檢測過程中存在的抗體抑制，能在確保操作簡單，高靈敏度的前提下檢測到低于3pg/mL的雜質，提供準確的檢測結果。專門適用于治療性蛋白及抗體純化過程中殘留的蛋白A檢測。
二、實驗原理
本試劑盒采用酶聯免疫吸附實驗雙抗夾心法檢測樣本中蛋白A的濃度。Elisa實驗開始前，首先將待測樣本及梯度稀釋后的標準品與變性液混合，室溫孵育使Protein A與抗體完全分離。待預處理完成后，先向預包被有雞抗蛋白A抗體的微孔中加入檢測抗體，后加入上述變性處理的標準品及待測樣品，利用抗原抗體特異性結合的特點在室溫下孵育，使樣本及標準品中的蛋白A被捕獲于聚丙烯微孔板上，經一段時間孵育后，使包被抗體、蛋白A及檢測抗體形成雙抗夾心復合物，洗板，洗去其它未結合的物質。加入顯色底物溶液。顯色結束后，加入硫酸溶液終止反應，顏色由藍色變成黃色。樣本或者標準品中蛋白A的含量與顯色顏色深淺成正比，據此可以計算待檢樣本中蛋白A的含量。
三、試劑盒優勢
1. 穩定性高：實驗采用特定的廣譜蛋白穩定劑和微孔板處理工藝，增加微孔板熱穩定性和結果的可重復性。
2. 實驗時間短：經優化后整個過程只需1.5小時，較傳統煮沸法大大縮短實驗時間。
四、試劑盒組分
名稱 | 規格 | 數量 | 保存 | |
1 | 已包被平底微孔板 | 96孔 | 1板（可拆卸） | 2-8℃密封冷藏 |
2 | 標準品母液(1μg/mL) | 20μL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
3 | HRP標記的檢測抗體（100×） | 150μL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
4 | 樣品預處理液 | 5mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
5 | TMB | 10mL | 1瓶 | 2-8℃避光冷藏 |
6 | 終止液 | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
7 | 洗液（100×） | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
8 | 樣本稀釋液(10×) | 10mL | 1瓶 | 2-8℃冷藏 |
9 | 檢測抗體稀釋液（1×） | 10mL | 2瓶 | 2-8℃冷藏 |
10 | 封板膜 | 4張 | ||
11 | 使用說明書 | 1份 |
請將請按照試劑標簽提示的貯存條件存放試劑，并請在保質期前使用。
五、實驗需要但未提供的耗材及設備
1. | 移液器：10μL-1000μL | 7. | 多道移液器 |
2. | 滅菌的去離子水或超純水1L | 8. | 滅菌EP管 |
3. | 吸水紙 | 9. | 酶標儀 |
4. | 高速離心機 | 10. | 洗板機或者洗瓶 |
5. | 恒溫箱或水浴鍋 (可選) | 11. | 數據分析及繪圖軟件 |
6. | PBS（pH 7.4）配制方法：NaH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g， | ||
于超純水中完全溶解后定容至1000mL。 | |||
六、樣本收集和保存
1. 血清：血液采集時不加抗凝劑，室溫靜置1-2小時，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
2. 血漿：血液采集時要加入總體積1%的抗凝劑（EDTA、肝素等），采集后先室溫或4℃靜置半小時后，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
3. 組織裂解液：組織裂解的方式取決于組織的類型，一般來講，先用預冷的PBS清洗組織后稱重。一般0.3g-0.5g組織加入500μL預冷的PBS，在冰上的玻璃容器內研碎。用超聲或者反復凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
4. 細胞裂解液：懸浮細胞直接離心取細胞沉淀。貼壁細胞需用胰酶消化后離心取細胞沉淀。檢測某些指標時不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重懸細胞，超聲或者反復凍融的方法裂解細胞膜，1500×g（或5000rpm）離心15分鐘分鐘后取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
5. 細胞上清液：收集培養的細胞，1000×g（或3000rpm）離心15分鐘，取上清，-20℃或-80℃分裝保存備用。
七、實驗前的準備
1. 請仔細閱讀試劑盒說明書，實驗過程在室溫下操作即可(20-25℃），如溫度較高或較低，可置于37℃恒溫培養箱。
2. 樣本的準備：將化凍后的凍存樣本，混勻后，12000rpm離心1分鐘，取上清作為待檢樣本備用。
注意:
u 若您使用說明書中未列舉的樣本，請進行預實驗看本試劑盒是否適合您的實驗。
u 由于在細胞穩定性，細胞數目，及采樣時間上存在差異，細胞培養上清樣本可能無法被本試劑盒檢測。
u 建議您使用新鮮的或者儲存時間不長的樣本用于分析測試。否則，樣本中蛋白質的降解及變性會導致錯誤的實驗結果。
u 實驗樣本的最佳PH值在7.0-7.4之間。
八、試劑的準備
1. 實驗前請將所有試劑及樣本恢復到室溫（20-25℃）。
2. 洗液的稀釋：量取10mL 100×洗液母液，加入990mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以穩定保存2周。
3. 樣本稀釋液（1×）：量取10mL 10×稀釋液母液，加入90mL去離子水或超純水，混勻備用。如果濃縮液中有少許結晶，請將其置于室溫，并輕輕震蕩至晶體完全溶解，1×稀釋液制備后請盡快用完。
4. 樣本的預稀釋：如果您的樣本預測濃度高于本試劑盒最高檢測限度，建議使用PBS對樣本進行稀釋。
5. 標準品的稀釋：配置標準品時提前標記7只樣品稀釋管，預加入一定體積的稀釋液，即S1（499μL），S2至S7（各150μL）。取標準品母液（濃度為1μg/mL）1μL加入到標記為S1的管中，吹打混勻后，取150μL濃度為2000pg/mL的標準品S1到下一管，之后以2倍梯度稀釋至S7（稀釋過程如下圖）注：標準曲線有7個點，分別命名為S1、S2、S3……S7。其中S即標準曲線的最高濃度點（2000pg/mL）。
6. 標準品/樣本的準備：將稀釋好的待測樣本及不同濃度標準品與樣品預處理液按照2:1體積混合(如 100μL標準品或樣品加入50μL預處理液)，輕輕吹打10-15次，室溫，靜置孵育5-10分鐘備用。
7. HRP標記抗體工作液（1×）：取100μL HRP標記抗體（100×），加入10mL檢測抗體稀釋液（1×），混勻即可。
九、實驗步驟
1. 撕開包裝袋，取出包被有抗體的酶標板，拆下不需要使用的板條，并用封板膜封好，放回鋁箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重復使用）
2. 向微孔板中先加入100μL HRP標記抗體工作液（1×），再加入25μL經預處理的7個不同濃度的標準品及待測樣品，貼上封板膜，室溫，400-600rpm，孵育1小時。
注：加入25μL標準品及待測樣品時保持槍頭在抗體液面以下，避免產生氣泡。
3. 洗板機洗板：
? 取出稀釋好的洗液放置于洗板機的洗瓶中備用。
? 取出上步中的微孔，甩去微孔中的液體，洗板機洗板5次。
? 洗板完成后，將微孔板倒扣在吸水紙上拍打，充分拍干至無明顯水膜為止。
或手動洗板：
? 取出稀釋好的洗液放置于洗瓶中備用。
? 取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液體，在吸水紙上輕輕拍打至無明顯液滴。
? 用多道移液槍向每個微孔中加300μL洗液，靜置20s，倒去洗液，將微孔板倒扣在吸水紙上輕輕拍打。重復5次。注：第五次洗板時，充分拍干至無明顯水膜為止。
4. 顯色：向每個孔中加入100μL底物TMB，貼上封板膜，室溫環境下，靜置避光顯色10-30min。
5. 顯色終止及讀板：直接向含有底物的微孔中加入50μL的終止液，終止反應，輕輕震蕩混勻，立即轉移到酶標儀上，在450nm下讀取吸光度值。
十、注意事項
（一）樣本收集注意事項
1. 樣本收集完畢后，要分裝保存在-20℃（少于3個月）或-80℃（少于6個月）以保持蛋白活性，避免污染和反復凍融。如果要在24小時內分析樣本，可以保存在2-8℃。
2. 冷凍樣本使用前請保證充分化凍（請勿加熱融化樣本），使用前用移液器或者Vortex混勻，樣本液中含有沉淀物會對ELISA有干擾，可離心去除。
3. 某些化學裂解液（如SDS，Triton等）可能會對本實驗造成干擾，謹慎使用。
4. 若母液（標準品，檢測抗體及酶液）出現渾濁，輕輕振蕩或吹打即可。
5. 建議所有標準品及樣本都設置復孔。向微孔中加入試劑或樣本后，請輕輕震蕩使液體混勻，并盡量保證不要有氣泡。
6. 高脂血或溶血的樣本含有豐富的過氧化物酶，對ELISA有干擾，導致檢測結果非特異性升高，不建議使用。
（二）實驗操作注意事項
1. 請不要將本試劑盒的試劑與其他試劑盒試劑交叉使用。
2. 實驗操作使用一次性吸頭，避免交叉污染。
3. 加樣：加樣時要控制時間和速度，一般加樣時間控制在10分鐘內。如果樣本數量過多，可使用多道移液器。
4. 洗滌：洗滌時微孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上充分拍干，并要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響最后的酶標儀讀數。
5. 由于底物TMB溶液是光感性的試劑，使用前請勿長時間暴露于可見光下。同時要避免TMB與金屬接觸。
6. 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請提前加入終止液終止反應。
7. 本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。
8. 標準曲線的R2≥0.95。
9. 拍板示意圖:
十一、數據處理
1. 對樣本及標準品各自對應的復孔OD值取平均值。減去空白孔OD值后帶入標曲。
2. 以標準品的OD作為Y值，標準品的濃度作為X值，推薦選擇四參數logistic (4-PL) 曲線擬合。
3. 將樣本OD代入到標準曲線方程中計算樣本中待檢樣本的濃度。
4. 以下曲線僅供參考。
附件一、標準曲線實例
十二、質量控制
1. 批內差：7-8% 批間差：6-9%
2. 靈敏度 LOD：3.9pg/mL LOQ：31.25pg/mL
3. 回收率：初次實驗時，應通過加標回收率確認樣品基質對實驗結果有無干擾。建議每3倍體積的待測樣本加入1倍體積的標準品（S1：2000pg/mL），計算時采用加標后樣品實際濃度減去加標前樣品實際濃度，除以理論濃度即500pg/mL，判斷回收率是否在80-120%。對樣品檢測有干擾的基質來源主要有極端pH值（pH<5或pH>8.5），較高鹽濃度及去污劑等會導致回收率偏低。有時高濃度的抗體產物也會對檢測結果有影響，建議多稀釋幾個倍數再進行實驗。
4. 勾狀效應（Hook Capacity）：本試劑盒是一個三步法的夾心ELISA試劑盒，樣本在高含量蛋白A的情況下會受到鉤狀效應的影響，請用試劑盒稀釋液稀釋樣本，使其蛋白A濃度在本試劑盒的檢測范圍以內。
5. 局限性：本試劑盒不適用于含有疊氮化鈉(NaN3)的樣本，因為疊氮化鈉是HRP的強抑制劑，會降低檢測到的蛋白A濃度。
應用：定量檢測生物醫藥生產純化過程中SPA殘留檢測（如純化發酵液，細胞培養上清液等）
用途：本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床及診斷使用！
1. 本試劑盒顯色底物TMB 3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine (TMB)，有一定的致病風險。如果接觸到TMB，請用大量的水沖洗。
2. 終止液是硫酸溶液，請勿讓眼睛皮膚及衣物接觸終止液。操作時帶上手套，實驗服及面罩。
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