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一、產(chǎn)品介紹

本試劑盒采用Taqman探針熒光定量PCR法，設(shè)計(jì)專屬探針和關(guān)鍵引物，特異性好，靈敏度高，其最低定量限可以達(dá)到1fg/μL水平。DNA參考品制備過程與其它宿主細(xì)胞DNA國家標(biāo)準(zhǔn)品制備一致，因此純度高，無蛋白及離子干擾，保證了待測(cè)樣品含量檢測(cè)的準(zhǔn)確度。試劑盒提供DNA稀釋專用稀釋液，單次實(shí)驗(yàn)復(fù)孔平行性及多次實(shí)驗(yàn)間數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。

二、試劑盒組成

* ROX參比染料為可選，是否使用取決于使用的儀器。具體可參照PART 6中的說明。

三、實(shí)驗(yàn)需要但未提供的耗材及設(shè)備

四、運(yùn)輸和保存方法

1) 所有組分均干冰運(yùn)輸。

2) 試劑盒需-20℃保存，建議一年內(nèi)使用完。其中組分B2需避光保存。

3) B2/B3/B4組分在-20℃可以保存兩年，B1/B5/B6 組分在-20℃可以保存一年。此外B1/B5/B6 三個(gè)組分也可以一起另外購買。

五、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1) 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書，所有成分使用前應(yīng)完全化凍，低速離心，震蕩混勻。

2) 從-20℃冰箱取出，將組分B1(2X qPCR Mix)和B6（50X ROX Reference Dye）分別融解，輕輕顛倒（盡量避免產(chǎn)生泡沫），待溶液完全均一后再行使用。注：如B1(2X qPCR Mix)和B6（50X ROX Reference Dye）需一段時(shí)間內(nèi)經(jīng)常取用，可在2-8度條件下儲(chǔ)存3個(gè)月。盡量避免反復(fù)多次凍融；如解凍后沒有使用，須徹底混勻后重新冷凍。

3) B2 (Primer & Probe Mix) and B4 (DNA Control)在使用前混勻時(shí)切勿反復(fù)吹打，可采用類似清洗管壁方式。注：為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將B4 (DNA Control)分裝儲(chǔ)存于-20℃。

4) 已融化未使用的B3 (DNA Dilution Buffer)可保存于2-8℃ 7天，若長(zhǎng)時(shí)間不用，請(qǐng)放置于-20℃。

5) 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作，實(shí)驗(yàn)開始前后紫外照射30min以消除環(huán)境中潛在的DNA污染源。

6) 由于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)有極強(qiáng)的靈敏度，保持工作環(huán)境的潔凈非常重要，實(shí)驗(yàn)開始前建議完全清潔移液器及周邊工作環(huán)境，移除清理實(shí)驗(yàn)過程中用不到的任何物品。

六、操作過程

（一）DNA定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1） 將試劑盒中的DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上完全融化，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2） 取7支潔凈的200μL PCR管，分別標(biāo)記為S0，S1，S2，S3，S4，S5，S6，每管各加入45μL DNA稀釋液。

3）在標(biāo)記為S0的PCR管中加入5μL DNA Control (10 ng/μL)，即1000pg/μL，快速離心10 sec，振蕩5sec，再快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-20℃短期保存（不超過3個(gè)月），使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

4） S1，S2，S3，S4，S5，S6管稀釋操作同S0，稀釋方法如下：

（二）反應(yīng)體系

【注】：

1）根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需Mix混合液總量：Mix混合液=（反應(yīng)孔數(shù)+4）*（12.5+2+5.5）μL（含有4孔的損失量），建議冰上操作。

2）標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本每個(gè)濃度做 3 個(gè)復(fù)孔。上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍適用大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)實(shí)際需要適當(dāng)調(diào)整，如3fg/μL-300pg/μL等。

3）實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)保持一致。加樣完成密封好管子后，請(qǐng)低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec，如有氣泡，需將氣泡排盡。

4）為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，建議用1X PBS將溶液中蛋白濃度稀釋至1-10mg/ml進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，確保回收率在50%~150%之間。

5）幾種常見儀器的匹配ROX Reference Dye濃度見下表：

（三）擴(kuò)增程序設(shè)置（2步法）

1）PCR反應(yīng)的預(yù)變性條件必須設(shè)定為95℃，15min。

2）選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為“FAM”，猝滅熒光基團(tuán)為“TAMRA”。

3）變性*：請(qǐng)按照儀器使用說明書對(duì)不同型號(hào)的儀器進(jìn)行時(shí)間。使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOnePlus時(shí)可設(shè)定為1sec。

4）退火/延伸*：請(qǐng)按照儀器使用說明書對(duì)不同型號(hào)的儀器進(jìn)行時(shí)間。幾種常見儀器的時(shí)間設(shè)定見下表：

七、判定標(biāo)準(zhǔn)

1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線：R2>0.99；擴(kuò)增效率(Eff%)：90%≤Eff%≤110%；斜率（Slope）：-3.8~-3.1。

2) 加標(biāo)回收率% = (加標(biāo)樣品測(cè)定值－樣品測(cè)定值) /加標(biāo)理論值*100%，范圍50%-150%。

3) 無模板對(duì)照（NTC）：即反應(yīng)體系中用DNA稀釋液代替待檢測(cè)模板，其余成分不變，其檢測(cè)結(jié)果Ct值應(yīng)為Undetermined或Ct值≥35。